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非侵入性唐氏症篩檢主要分為兩大區塊
(1)測量孕婦血清的幾種蛋白質的濃度,並以超音波測量胎兒頸部透明帶的厚度,估算胎兒罹患唐氏症的機率,如果血清估算出來唐氏症或愛德華氏症的風險超過1/270,就屬於高危險群,考慮羊膜穿刺。但僅憑蛋白質濃度的估算,包括所謂的初唐和中唐的篩檢。其假陽性(風險值偏高但胎兒正常)和假陰性率(風險值很低但胎兒卻罹患唐氏症等)都不低,簡單地說準確度不高,所以目前使用的機會越來越少。另一方面,測量胎兒頸部透明帶(nuchal translucency,NT)在篩檢染色體異常方面有相當不錯的準確度,尤其在厚度超過正常的3mm以上者,準確度很好,約有40%-50%異常,包括唐氏症、愛德華氏症、巴陶氏症、透納氏症和一些不平衡染色體結構異常。
(2)利用孕婦血漿內含微量的胎盤DNA,篩檢唐氏症是目前常見的NIPT,也是本文的重點。這種方法利用胎盤細胞凋亡(apotosis)後,進入母體血液循環的短片段DNA,這些小分子佔母體血漿DNA總量約5-15%。早在1989一位香港華人Dennis Lo發表孕婦血漿含有胎盤DNA,開啟了NIPT的新頁。假如胎兒罹患唐氏症,則其第21號染色體的DNA量會增加50%,但第21號染色體很小,只有48 Mb,佔整個3200Mb基因體只有1.5%。假設來自胎盤的DNA佔比為10%,理論上懷唐氏症兒孕婦血漿其第21號染色體的總量應該從原來的1.5%,增加到(1.5% X90% ) + (1.5% X1.5 X10%) = 1.575%,只是極微幅的增加,以傳統的方法沒有辦法檢測1.5%與1.575%的差異。幸好10幾年來次世代定序(Next Generation Sequencing,NGS)的技術進步神速,前述的0.075%的差異利用NGS可以辨別,NIPT終於可應用在臨床。NGS可同時定序1000萬條DNA,屬於等21染色體的有15萬條,來自胎盤的約15000條;胎兒如為唐氏症者,屬於胎盤的有22500條。NGS雖然可以快速大量定序,但沒有辦法分辨母親與胎盤的DNA。利用生物資訊的演算,每條DNA可以歸類到其原來的染色體,之後再計算每條染色體的DNA分子數,將第21號染色體的分子數除以總分子數,得到的百分比再與對照組的平均值比較,計算結果以平均值正負N個標準誤差(Standard Deviation、 SD、 Z 值)表示。如果一個檢體的第21號染色體測量值超過對照組正3個標準誤差(Z 值 >3),代表胎兒為唐氏症高危險群,但這並不等於胎兒罹患唐氏症,應該利用絨毛採樣或羊膜穿刺才能確診。

羊膜穿刺(或絨毛採樣)的染色體分析跟NIPT最大的差異:
(1)羊膜穿刺+染色體分析屬於診斷檢驗,涵蓋所有23對染色體的數目和成千上萬種染色體結構的狀況。精準度超過99.5%以上,假陽性和假陰性率接近於零。
(2)NIPT是一種篩檢方法,其準確度和檢查的範圍跟染色體檢查差了一大截。如同以糞便潛血篩檢大腸癌,有潛血並不等於大腸癌。要評估NIPT的篩檢效能需要先瞭解一些指標,如靈敏度(sensitivity)、陽性預測 值(PPV, Positive Predictive Value)、假陽性、假陰性等等。所謂靈敏度指的是把已知唐氏症胎兒的孕婦血漿,用NIPT測得陽性的機率。相反的,PPV是拿未知結果孕婦血漿,經NIPT測得陽性的個案,其胎兒最終真正為唐氏症的機率。靈敏度的研究是在實驗者可以控制的最佳情況下進行,通常可以得到較好的結果;PPV則是在真實臨床情境中進行,受檢者和檢驗者都不知道真正的結果,宛如新藥研發時的雙盲試驗(double blind test)較能反應真正的療效或精準度。PPV的統計會受到疾病在該族群的發生率的影響;利用同一套篩檢方法,疾病發生率較高的族群其PPV會比發生率低的來得高。理論上, NIPT 篩檢唐氏症的PPV一定低於靈敏度(表1)。

表1: 假設靈敏度和特異性皆為0.999, NIPT在不同年齡T-21(唐氏症) T-18(愛德華氏症) T-13(巴陶氏症)的陽性(PPV)及陰性預測值(NPV)

母親年紀 10周的發生率 PPV NPV
20歲 T-21  1/800 0.556 0.999
T-18  1/2000 0.333 0.999
T-13  1/6500 0.133 0.999
30歲 T-21  1/470 0.844 0.999
T-18  1/1200 0.455 0.999
T-13  1/3700 0.213 0.999
40歲 T-21  1/50 0.953 0.999
T-18  1/130 0.886 0.999
T-13  1/400 0.715 0.999

例如唐氏症在20+歲年齡層的發生率低於40+歲的孕婦,因此20+歲孕婦的PPV一定低於40+歲的PPV。很多孕婦甚至醫療人員都把靈敏度當做PPV,這是很大的誤解。不管美國或國內的結果,很清楚NIPT篩檢唐氏症的PPV都低於靈敏度:美國的報告低了5%,國內的更相差達15%。唐氏症是所有胎兒疾病中最常見的,約佔45-50%,其它的包括愛德華氏症、巴陶氏症,透納氏症、克氏症、三倍體(triploidy)、無數類的不平衡染色體結構異常(缺失或重複)總和起來也只佔一半左右。較少見的異常因為發生率低,因此其PPV一定與靈敏度差距更遠(表1)。除了上述假陽性問題之外,比較麻煩的是假陰性,即NIPT顯示正常或很低的唐氏症風險,但出生的寶寶卻罹病,近幾年來國內應有10例左右的唐寶寶因此出生,其他染色體數目或不平衡結構異常的個案沒被篩檢出來的就更多了。國內外的廠商和實驗室都宣稱NIPT對唐氏症篩檢的靈敏度高達99%,就算這是事實,但理論上PPV值一定低於靈敏度(表1),實際上美國和國內的資料也證明這點(表2,3),國內的偏差值更大於美國。

表2: 103例NIPT陽性個案與胎兒實際狀況的比較(美國2014年報告)

NIPT 個案數 吻合 不吻合 分析
T-21 41 38(93%) 3(7%) 3例正常
T-18 25 16(54%) 9(36%) 8例正常,1例為平衡轉位
T-13 16 7(44%) 9(56%) 9例正常
性染色體 16 6(38%) 10(62%) 9例正常,1例20p12重複0.7 Mb
T-16 3 1(33%) 2(66%) 2例正常
45, -21 2 0 2(100%) 2例正常
22q11.微小缺失 1 0 1(100%) 1例正常
陰性結果 4 0 4 T-21, T-9, 47, +marker, 45,X/46,XX各1

表3: 國內近年來115例經NIPT篩檢為陽性者經絨毛採樣或羊膜穿刺的確診結果 (NIPT錯誤個案的染色體分析皆正常)

NIPT 個案數 正確 錯誤
T-21 50 41(82%) 9(18%)
T-18 22 14(64%) 8(36%)
T-13 12 1(8%) 11(92%)
性染色體 31 8(26%) 23(74%)

 


如果觀查發生率較低的愛德華氏症、巴陶氏症、透納氏症和其他性染色體,可以很清楚看出PPV值和靈敏度的差距更大。例如40歲的孕婦罹患胎兒唐氏症的機率高達1/50,NIPT的PPV為95%左右;20歲的孕婦群因為唐氏症的發生率只有1/800,所以其PPV掉到55.6%。同樣的道理40歲的孕婦群巴陶氏症的發生率為1/400,其PPV為 71.5%,而20歲的孕婦群發生率只有1/6500,PPV掉到只有13.3%,換句話說,這群孕婦接受NIPT後,即使被告知胎兒罹患巴陶氏症,8位裡面錯了7位。2014美國有三篇論文分析224例接受NIPT篩檢,顯示胎兒為第21、18、13或性染色體異常,經過絨毛採樣或羊膜穿刺後,唐氏症的PPV為94%,與40歲的孕婦群的理論值相同。愛德華氏症的PPV為60%,約等於35歲孕婦的理論值。巴陶氏症的PPV為44%,也與35歲左右的孕婦群相似;另外也至少發現4例假陰性(包含一例唐氏症)(表2)。國內使用NIPT也超過了5年以上,由很多不同檢驗單位篩檢出陽性的個案,共有115例到本院進行絨毛採樣或羊膜穿刺的確切診斷,結果如表3所示:唐氏症的PPV只有80%,愛德華氏症PPV只有40%,巴陶氏症不到10%,性染色體只有20%,比起美國的精準度差了一大截。

影響NIPT陽性預測值(PPV)的因素

NIPT的PPV受到以下因素影響
(1)胎盤DNA的比率,小於3%者準確度會降低,因此孕婦體重超過80公斤者,體脂肪比率上升,脂肪細胞的凋亡會增加孕婦本身的DNA量,進而相對減少胎盤DNA的比率。
(2)NIPT進行時的“讀深”。所謂讀深代表DNA分子被定序的片段數目,比較讀深為1000萬條和100萬條,可以發現在1000萬條讀深下,患者和對照組之間的差距會較為明顯,換句話說,誤判的機率會降低。
(3)疾病的發生率。同樣一套檢驗系統,運用在發生率高的族群會比使用於低發生率的族群,其PPV會提高。表1使用一種靈敏度和特異性都高達99.9的NIPT平台,理論上對於40歲的孕婦,其唐氏症的PPV值會高於愛德華氏症、巴陶氏症和性染色體異常(表1),這種趨勢不管是歐美或國內的族群基本上類似,但國內的PPV值確遠低於美國的資料(表2,3)。

NIPT是否可檢查出微小缺失或單基因突變點
國內也有一些實驗室聲稱可以檢查基因體的微小缺失或重複,甚至基因的單點突變。國外雖然有少數文獻報導NIPT也可用於6種微小缺失或重複篩檢,但單點突變卻仍在研究階段或以其他平台進行。就理論來說,每一種微小缺失或重複的發生率都不高,但種類是天文數目,因此總和起來的個案就不少。例如罕見疾病的發生率皆低位1/1000。但種類高達7000種以上,因此美國人約有10%的人罹患某一種罕見疾病,世界罕病協會的口號(Alone we are rare. Together we are strong.)就充分顯示微小缺失或重複症候群的真實現況。有所謂的”6合一、N合一的NIPT,實際上重點還是只有唐氏症的篩檢,例如Alagille 症候群發生率為1/70000,Kleefstra的發生率為1,000,000之1,其他不少症候群迄今全世界只有10-20例左右的報告,根本無從估算發生率,相信國內99.99%以上的醫師一輩子也看不到一例。當然國內也有幾例NIPT發現胎兒有微小缺失或重複,經過絨毛採樣或羊膜穿刺後,幾乎所有胎兒的變化都來自母親的遺傳,換句話說,這些NIPT偵測到的主要還是母親的DNA變化,這種變化也沒有臨床意義。

NIPT能否取代羊膜穿刺檢查
國內很多人誤以為NIPT的準確度跟羊膜穿刺+染色體檢查差別不大,其實兩者在很多方面都不一樣。孕婦血漿確實含有少量胎盤DNA,但目前的科技並沒有辦法把胎盤DNA從母血中分離,NIPT是把兩者混在一起檢驗的。宛如拿一西西先生的血液,混合九西西的太太的血液,要測量先生的血糖或肝功能,其準確度絕對比只抽3西西的先生血液的檢驗差很多。羊水細胞是純粹的胎兒細胞,檢查結果直接又肯定。孕婦害怕羊膜穿刺有幾個原因
(1)擔心穿刺會造成流產。羊膜穿刺在國內已有接近40年的歷史,在有經驗的醫師操作下,流產率低於1/1,000,國外文獻甚至低到0.6/1,000。
(2)害怕胎兒被針扎到,或胎兒會用手去抓針而受傷。這種網路錯誤消息可真不少。羊膜穿刺在超音波導引下進行,可以完全避開寶寶。何況在治療胎兒疾病(如胎兒腹水或胸腔積水)時,醫師要在胎兒大腿打麻醉劑,接者又要在腹部或胸部扎針,寶寶健康出生後跟本找不到針孔。羊水腔裡面完全沒有光線,胎兒不可能見到針:足月的新生兒也不會用手抓東西,4個月大的胎兒如何抓針頭?胎兒在羊水中不時動來動去,有時候會看到胎兒的影像跟針頭碰在一起,其實這些大部分是重疊畫面,就算胎兒身體跟針頭貼在一起,也不會傷害寶寶。
(3)怕痛。肚皮的神經分佈較稀疏,羊膜穿刺的針也比一般抽血的針來得細,所以羊膜穿刺比抽血應較不痛。
NIPT對於唐氏症的篩檢確實比過去的初期或中期唐氏症篩檢進步不少,但NIPT畢竟就是篩檢,所以它還是有假陽性和假陰性存在。選擇羊膜穿刺要冒1/1,000左右的風險;選擇NIPT的風險是錯失及早診斷多種染色體和微小缺失和重複的疾病,後者的風險應遠大於前者。


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