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基因劑量(gene dosage)診斷技術--MLPA

何謂"MLPA"
   
MLPA是Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification的簡稱,由荷蘭的Dr. Schouten JP所帶領的研發團隊於2002年發表,是一種靈敏度極高的相對定量技術,乃利用簡單的雜合(hydriation)、連接(ligation)及PCR增福(PCR amplication)反應,於單一反應管內可同時偵測最多40個不同的核苷酸序列的拷貝數變化。
    由於MLPA操作簡便、成本低廉、應用領域廣,這幾年來,已超過有上百篇的研究報告發表。在歐洲,更有多家遺傳醫學中心及實驗室採用此技術發展出的系統,協助進行多項基因檢測的工作。

利用MLPA技術檢測SMA的優點:

靈敏度高(High sensitivity)
MLPA每次反應只需大約20 ng以上DNA,且毋須準確定量。
再現性高(High reproducibility)
利用40-100 ng之DNA檢體進行檢測,其每一探針之變異係數(Coefficient of variability)僅3-8%。也就是說,只要DNA檢體量足夠(建議在50-500 ng之間),所得到的結果再現性非常高。不若其他定量方法會因DNA定量的不準確,導致結果誤差。
簡單(Simple)
每一反應只需在同一試管內進行。
高處理速度(High throughput)
MLPA搭配自動化設備,可在三小時內同時處理96個檢體。檢體從DNA萃取、反應至結果分析,僅需兩個工作天。
低耗費(Low cost per data point)
反應所須之所有試劑均包含於MLPA試劑組中,所須之儀器設備亦為大部分分子診斷實驗室現有的,無須另行添購。
反應量及品質的監控(Quantity & quality control)
MLPA檢測包含有監控DNA品質及反應品質的控制組探針,可同時監控DNA反應量是否足夠與反應是否正常。
可精確診斷出SMN基因的套數比
MLPA檢測搭配有十數個控制組探針(位於不同染色體上),經過標準化(normalization)運算,可避免單一探針反應之誤差而導致定量錯誤,所得到之定量結果準確度也大幅提高。而其他定量檢測方式,由於偵測反應中沒有或只有1-2個控制組探針(internal control),故準確性不若MLPA,尤其在判斷2:2正常或1:1帶因者時,容易產生誤差;而對於2:3的正常人,也容易判定成1:2的帶因者。

 

 

MLPA的原理圖

說明:MLPA透過設計的專一探針組(如1A,1B; 2A, 2B),可以黏合(anneal)至目標序列,若完全黏合,則連接酵素(ligase)會將兩條探針連接為(1A+1B)及(2A+2B)之片段,可利用通用引子組(Primer X及Primer Y)進行PCR增幅反應,將(1A+1B)及(2A+2B)片段增幅,以利後端片段分析。若目標序列缺失(deletion)或產生突變,則兩條探針組無法連接成功,則不會有(1A+1B)或(2A+2B)之增幅產物。

 

MLPA的其他應用領域:

    至今此技術已應用於多種領域的研究及基因診斷上,如染色體數目異常(Trisomy13、18 & 21)、遺傳疾病基因缺失重複(如SMA、DMD基因…等)、基因甲基化偵測(如Prader-Willi syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS))、抑癌基因診斷(如Breast cancer、Lung cancer…等)及mRNA分析等。至今已發展出的檢測探針種類,已超過上百種。在這兩三年間,應用MLPA技術所進行的研究成果,也陸續在國外專業期刊中被發表及肯定。

 

利用MLPA技術進行國內SMA檢驗的成果已發表於國際期刊:
 利用MLPA技術檢測SMN基因套數【Genet Med 2007:9(4)241-248】