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柯滄銘教授專欄  

衛教資訊

DNA短縱列重複序列(short tandem repeat)
在醫學和鑑識科學上的應用 
柯滄銘婦產科 柯滄銘

      人類基因體序列的草圖已於2000年完成,目前已知的基因大約為3萬5千個,人體的基因體中只有3%左右的序列組成基因,其餘的97%的序列跟基因的構造沒有關係。雖然人與人之間99.9%以上的DNA序列是相同的,但每隔大約1千個核甘酸就可能出現DNA的變異。這種DNA的變異以很多種方式呈現,有的是單一核甘酸的改變,有些是重複序列次數的改變,其中最常見的是短縱列重複序列(short tandem repeat,STR)。STR的核心組織為2至8個核甘酸不等[1],以常見的(CA)n和(CAG)n兩種STR為例:(CA)n如果重複七次就是CA CA CA CA CA CA CA,長度為14個核甘酸;而(CAG)n如果重複六次就是 CAG CAG CAG CAG CAG CAG,長度為18個核甘酸。人類的基因體含有上萬個STR,相對於基因體內的其他序列,STR在染色體減數分裂時是比較不穩定的結構,比較容易產生突變,例如(CA)6突變為(CA)5或(CA)7;(CAG)6突變為(CAG)5或(CAG)7,每一處的STR經過一代發生突變的機率約為1/1000 [2]。除了突變之外,99.9%的機率STR都是非常穩定地從親代傳到子代,每一特定處的STR經過代代相傳之後,可能會出現多種不同的對偶基因型,有些STR出現十多處的對偶基因型。分析這些高變化性的STR對於診斷單一基因疾病、人身鑑定、以及親屬血緣關係鑑定很有幫助 [3-5]。
以STR協助診斷單一基因疾病
  STR存在於基因內或兩個基因之間。有一些存在於基因內的STR可能跟基因的表現或功能有關,目前已知有很多種疾病是因為STR的過度擴增造成的。例如最常見的一種遺傳性智障Fragile X症(脆弱X染色體症),其病因是FMR基因的5’ untranslated region處的"(CGG)n 參核甘酸STR出現大幅度的擴增(n<50為正常、50<n<200為帶因的前突變、 n>200為患者)才致病的,其他還有很多種神經退化疾病,如漢亭頓氏症、小腦萎縮症、脊髓小腦萎縮症、強直性肌肉萎縮症等都和基因裡面的STR的重覆次數擴增有關[6,7]。
  大部份的STR都是中性的,就好像膚色和頭髮的捲直可代表一個人的特徵,但卻與智力無關。STR如位於基因附近則會跟基因一起遺傳到子代,這些STR的長度就是基因的特徵,例如膚色是一種中性的特徵,但如果有人指證刑案的兇手是黑人的,那麼膚色就會是一個極重要的指標。同理STR的判定在基因疾病的診斷方面扮演相當重要的角色,尤其是當基因很龐大或者同一基因可能有很多種不同的突變型時,要找到病人的基因突變型會極為困難。這時候比對基因內或基因附近的STR可以知道正常或缺陷基因是如何遺傳的,例如血友病的基因長達186,000核甘酸,而裘馨氏肌肉萎縮症的基因更長達2,400,000核甘酸,不同家族的血友病和裘馨氏肌肉萎縮症的基因突變型通常不一樣,要真正找到這類病人的突變型可能要幾個月或好幾年的時間,有些個案的突變發生於intron,更不容易檢查出來。碰到這些情況時,以連鎖分析的原理檢驗STR通常可以分辨正常和有缺陷的基因[8,9]。
以STR作人身或親子等鑑定
  STR除了可利用於疾病的診斷之外,更常用於人身鑑定、親子、手足、祖孫和伯叔關係的鑑定。雖然人與人之間的基本結構是一樣的,但只要仔細比較,就可以發現兩人之間其實有很多處差異。例如我們可以從兩個人的性別、身高、體重、髮色、髮型、聲音、手勢、步姿、衣著、膚色以及其他言談舉止來區別兩個人。通常我們只要確實掌握某個人的一些重要特徵,大致上就可以猜出到底是那一個人。1935年起鑑定人身關係利用的是ABO血型的判定,但基本上ABO血型只有4種,所以重複性太高,碰到同樣的血型時就無法區別[10]。1976年醫界引入了人類組織符合抗原(HLA)的檢查。HLA是變異性非常高的蛋白質,在骨髓移植前都要作這項檢查。由於HLA的高變化性,使得人身或親子關係的鑑別度提高很多,但仍有少部份的個案無法利用HLA得到答案[3]。1980年代分析DNA首先用於各類的鑑定,一開始使用的是限制酵素多元切點和迷你衛星片段的分析,這些檢查需要較多量且品質良好的DNA,過程耗時費力,往往需要二至三週才有結果。1990年代STR開始被應用於人身辨識,由於STR的高變化性,人身鑑定時只要分析13-15處高變化的STR,就可以非常清楚地分別兩個人。鑑別度大幅提昇,近年來利用螢光標幟的DNA引子,檢查的靈敏度更提高很多,只要100個細胞、大約1ng的微量DNA即足夠檢查。另外由於AB公司出品的DNA反應組劑和DNA序列分析儀的引進,使得STR的分析比起以前要方便很多[5,11]。
  利用STR作人身鑑定的基本原理是從每個人身上各處所得到的DNA其STR的基因型都會完全一樣,包括血液、口腔上皮細胞、髮根、精液、唾液等等的STR基因型都會相同。幾年前美國聯邦調查局制定了13處STR的檢驗系統,兩個不同的人,其13處STR的基因型完全吻合的機率只有20億之一,三年前AB公司更推出了第二代15處STR的分析,兩位不同的人剛好在15處STR都有相同基因型的機率只有50億之一而已,目前地球上的總人數也只有60億左右,所以除了同卵雙胞胎之外,每個人的15處STR基因型都是獨特的,兩個人碰巧完全吻合的機率幾乎不可能。利用這種原理,美國聯邦調查局領導美國的刑事偵辦系統從10年前開始逐步建立強暴犯或殺人犯的STR檔案,全美連線成立一個網路,互相利用建立的檔案偵辦案件,歷年來已有很多案件是利用STR的比對,找出犯案的人。國內的刑事警察局也已經從事類似的工作,對於打擊犯罪一定有很大的作用。
  利用STR分析作親子鑑定的學理是小孩的STR基因型一半來自父親,一半來自母親。。兩個人如果有父子或母子關係,則在每一處STR,子代的一個對偶基因型遺傳自父親,另一個對偶基因型則來自母親。兩個人如果沒有親子關係,則可以在二處以上的STR發現沒有交集的情形,即在特定STR處,子代的兩個對偶基因型皆與假設父親或母親的不同。利用這個原理,假設父親與小孩之間如果出現2處以上的可排除的STR基因座,基本上就可以排除兩人的親子關係。如果兩人之間在所有的STR基因座皆沒有辦法排除親子關係,即可根據兩人共有的基因座在一般人口出現的頻度,計算出兩個人在該STR基因座的親子關係指數。如果共有的基因座越罕見,則親子關係指數會越高[12]。例如假設父親與小孩之間共有一種很罕見的特徵,例如多指症,那麼兩人的親子關係機率就很高。相反地如果兩人共有的特徵都是很常見的情況,例如黑頭髮、黃皮膚、雙眼皮等等,那麼分析這些特徵,對於親子關係的鑑別度就幫助不大。同理假設父親與小孩之間共有的對偶基因型如很常見,則該處所代表的親子關係指數就不高。
  每分析一處STR基因位可以得到一個親子關係值,目前我們一般都分析15處STR,如果每一點皆無法排除親子關係,那麼我們就可以得到總合的親子關係指數,由些可計算出總和親子關係機率。依照目前的國際標準,如果假設父親與小孩之間的總合親子關係機率超過99%,則視同確認兩人的親子關係[13]。過去數年來,個人鑑定了1300對父子檔和900對的母子檔,90%以上的親子檔其親子關係機率皆超過99.9%以上,60%超過99.99%,25%超過99.999%[5]。在檢查的樣品和時機方面,很多人都認為只有利用"血液"才能鑑定"血緣"。事實上我們目前最常使用的DNA來源是口腔上皮細胞,而非血液,這樣可以使受測者免於抽血之苦,尤其是不易抽到血液的嬰幼兒。鑑定的時機也可以提早到產前,懷孕10週以後利用絨毛採樣或16週以後以羊膜穿刺都可以很容易地獲得胎兒的DNA供鑑定用[11,14]。
手足或祖孫關係鑑定
  利用STR的分析也可以鑑別手足、半手足(同父異母或同母異父的兄弟姐妹)和祖孫關係。根據遺傳學的原理,在某一特定STR處,手足兩人得到的對偶基因型有1/4的機率完全不同,1/2的機率共有一對偶基因型,另外有1/4的機率會擁有完全相同的兩對對偶基因型。同樣的道理,祖孫兩人有1/2的機率在特定的STR基因座,共有一相同的對偶基因型。所以鑑定手足及祖孫關係時,沒有所謂的排除點位,但根據兩個人共有的對偶基因型在一般人口出現的頻率,可以計算出兩人的手足或祖孫關係機率[15]。
  手足或祖孫關係比起親子關係較疏遠,所以如同樣鑑定15處STR,通常得到的關係機率值會較低。在極少見的情形下,經過15點的分析後,兩人的手足或祖孫關係機率可能不到10%,但如果兩人確實有手足或祖孫關係,那麼分析更多處的STR,應該會提昇其關係機率。過去數年來,筆者鑑定過300對左右的手足、半手足、祖孫和叔姪關係,有些個案需要分析30處左右的STR,有時候還要合併檢驗代表母系遺傳的粒腺體DNA序列,才能夠得到具體的鑑定結果。
結語
  隨著人類各類活動的逐漸增加,需要鑑定DNA的情況越來越廣,例如意件事件、性侵害的鑑定、病理組織切片或各類檢體是否標幟錯誤的判定、刑事案件時各類證物的鑑定、無名屍的處理、骨髓移植前後的比對等等。在親子等血緣關係鑑定方面,過去由於沒有方便簡易的方法,不是無法處理、鑑別錯誤就是含糊處理。新一代的STR分析使得各類的人身鑑定變為非常方便,只要利用極微量的DNA,在很短的時間肉就可以得到相當精準的報告。由於DNA辨識科學的進步,使得很多人心中長期的疑問得以水落石出,也使不少多年的懸案得以真相大白。
參考文獻
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[13] Office of the Attorney General of Texas: Child Support Enforcement: Executive Summary, Austin, Texas,1993;May.
[14] Liu M, Xin Z, Ivan B. Application of DNA profiling to paternity testing during early pregnancy. Hum Hered 1993;43:357-361.
[15] Wenke RE, Traver M, Chiafari FA. Determination of sibship in any two persons. Transfusion1996;36:259-262.


 

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