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黃建豪(MS)1, 張奕元(MS)1, 陳忠雄(BS)1,
郭妍希(BS)1, 胡務亮(MD,
PhD)2, Tommy Gerdes
(MS)3, and
柯滄銘(MD, PhD)1
1. 柯滄銘婦產科基因飛躍生命科學實驗室
2. 國立台灣大學基因醫學部
3. 丹麥哥本哈根大學Rigshospitalet醫院臨床遺傳部
摘要：
1. 目的：利用MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)技術精確診斷SMN基因套數。
2. 方法：共收集373名受檢者檢體，可分成三組：(1)無SMA家族病史者，共310名。(2) 18名SMA患者及45名SMA帶因者。(3)曾經由其他實驗室以DHPLC分析SMN基因套數的20名個案。所有檢體皆以荷蘭MRC-Holland專利生產之MLPA試劑組分析其SMN基因套數。
3. 結果：MLPA可準確區分出21種SMN基因套數型別。整個實驗流程最短可在48小時內完成。於第一組受檢者中，2:2(SMN1:SMN2)基因套數型別最為常見(52.90%)，其次為2:1 (30.32%)。共有6名(1.94%)為帶因者，其基因套數型別包括1:2及1:3。第二組受檢者中，SMA患者皆無SMN1基因，其SMN2基因套數從2-4套皆有。第三組受檢者中，3名以DHPLC檢測為帶因者，再以MLPA技術分析，結果皆不是帶因者。
第1組及第2組內總共發現51位帶因者，皆僅有1套SMN1基因及1~4套不等的SMN2基因。
4. 總結：利用MLPA分析SMN基因套數是一種簡單且有效率的方法，可快速且準確檢查出SMA患者及帶因者。
引言：
脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy, 簡稱SMA) 為一種常見的體染色體隱性遺傳疾病。主要是因SMN基因缺失導致脊髓的前角運動神經元漸進性退化，使肌肉逐漸軟弱無力、萎縮的一種疾病。其帶因率無論人種族群，約為1/40 ~ 1/60。SMA患者依發病年齡及疾病嚴重度可分為三型：第一型患者，在出生六個月內即會出現肌肉無力症狀，在兩歲前就會因呼吸衰竭而死亡。第二型患者，症狀常出現於出生後六個月至一歲半之間，可以坐、但無法自行站立或行走，大多可存活至4歲以上。第三型患者，症狀大多在一歲半以後發生，可以自行走路，但成年後，仍經常需要倚靠拐杖走路或輪椅代步。
控制SMA的基因為SMN基因。第五號染色體長臂有兩個DNA序列非常相似的SMN基因(SMN1及SMN2基因)。SMN基因由9個外顯子(exon 1, 2a, 2b, 3-8)組成，其終止密碼(stop codon)位於第7外顯子末端；SMN1與SMN2基因密碼區的兩處差異位於第7外顯子(840C>T)及第8外顯子(G>A)。SMN1基因製造的SMN蛋白質大部分具完整功能，而SMN2基因只製造出非常少量具完整功能的SMN蛋白質，因此SMN1的功能大約為SMN2的10倍。由於SMN1與SMN2基因序列區塊具有高度相似性，導致SMN1與SMN2基因容易發生缺失(deletion)或轉換(conversion)。約95%的SMA患者(包含第一、二與第三型)其SMN1基因發生缺失或轉換，其餘5%則屬於SMN1基因內的突變(intragenic mutation)。若患者2套SMN1基因皆缺失，則SMN2基因套數的多寡會決定該病患的嚴重度。SMA第三型患者比第一型患者具有4套SMN2基因的機率較高。分析SMN1基因套數的方式很多，包括single strand conformation polymorphism (SSCP), PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP), denatured high performance liquid chromatography (DHPLC), and real-time quantitative polymerase chain reaction…等方法。
2002年，Schouten等人發表MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)技術。它是一種全新且靈敏度極高的相對定量技術，乃利用簡單的DNA雜合(hybridization)、連接(ligation)及PCR增幅(PCR amplification)反應，於單一反應管內可同時偵測最多40個不同的核苷酸序列的套數。此技術已應用於多種基因缺失或重複之檢測，包括染色體數目異常、乳癌、大腸癌及DMD肌肉萎縮症等。至2006年底為止，也有兩篇論文利用MLPA進行SMA基因檢測的研究。我們在此篇論文中，則是利用MLPA分析台灣人的SMN1及SMN2基因套數，並比較20位受檢者以DHPLC及MLPA的結果。
材料和方法：
如前述，共收集373名受檢者檢體，區分成三組：(1)無SMA家族病史者，共310名。 (2) 18名SMA患者及45名SMA帶因者，共63名。 (3)由其他實驗室以DHPLC技術分析20名受檢者，其中19名被診斷為帶因者。所有檢體皆以荷蘭MRC-Holland專利生產之MLPA試劑組檢測SMN基因套數。
DNA萃取：依一般市售之DNA萃取試劑組，取2 ml血液之白血球，照標準方式萃取DNA。並以分光光度計測量DNA濃度。
MRC-Holland MLPA試劑組(P021 SMA)含有位於5q13區域(即包含SMN1&SMN2基因上下游區塊)的16個探針及位於其他染色體上的22個對照組探針。詳細探針序列及位置，可上網查詢(http://www.mrc-holland.com)。實驗步驟依照原廠建議之標準步驟進行。資料分析軟體係與丹麥哥本哈根大學Rigshospitalet醫院臨床遺傳部Mr. Tommy Gerdes合作研發。38個探針片段分析圖譜如圖1。
結果：
圖2~10分別代表SMN1:SMN2各種套數比的片段分析圖譜。若檢體套數比為1:1(圖3)及2:2(圖8)，其SMN2第7外顯子的波峰高度會略高於SMN1 第7外顯子；而SMN1與SMN2 的第8外顯子波峰高度則約略等高。於檢體2:0的圖譜中(圖6)，SMN2第7外顯子仍會有極少量的波峰訊號；SMN2第8外顯子則無訊號出現。而檢體0:3的圖譜中(圖2)，SMN1的第7外顯子及第8外顯子皆無訊號出現。由此推斷，SMN1第7外顯子序列的存在會增加部分SMN2第7外顯子的訊號產生。
將所有受測檢體分析出的波峰比值與對照組比較，我們可以得到SMN1、SMN2及其鄰近基因的套數。MLPA分析出來的訊號相當穩定，不同基因型的判定也相當肯定，從第一、二組分析出的21種基因型別波峰面積的平均值±標準差值來看，標準差大多小於10%。
第一組檢體共出現16種基因型別，最常見的為2:2(52.9%)，其次為2:1(30.32%)；共有6名(1.94%)SMA帶因者被檢測出；另外有8名受檢者帶有一套SMN1/SMN2混合型之基因型(表2)。
第二組中，所有18名SMA患者其SMN1基因皆發生缺失：7名患者為0:2、6名為0:3、5名為0:4。45名帶因者中，9名為1:1；27名為1:2；8名為1:3及1名為1:4(表1)。
第一及第二組中，有11名患者及20名帶因者其基因缺失範圍延伸至BIRC1基因，甚至到GTF2H2基因。所有7名0:2患者都至少有一套基因缺失範圍延伸至BIRC1基因exon 5(SMN1上游約58kb)；而所有0:4患者基因缺失範圍皆未涵蓋至BIRC1基因exon 5(表3)。7名0:2 SMA患者中，有6名為第一型，1名為第二型。6名0:3 SMA患者中，5名歸類為第二型，1名為第一型。5名0:4 SMA患者，在臨床上皆為第三型。
第三組中，20名受測者皆曾接受其他實驗室以DHPLC分析SMN基因套數。其中14名檢測結果與MLPA結果相吻合；而另外6名則不吻合。其中3名以DHPLC檢測為帶因者，但MLPA檢測結果為非帶因者(表4)。【本文投稿後，陸續再接到32名以DHPLC檢測為帶因者，但經MLPA檢驗後發現其中有16名並不是帶因者。因此，DHPLC檢測為帶因者的偽陽性似乎高達50%。】本實驗檢測出的21種基因型別中，16種在第一組的受檢者中發現(表1)；另外5種(0:2, 0:3, 0:4, 1:1, 1:4)則出現於第二組的受檢者中。
討論：
SMN1基因套數分析對於SMA帶因者篩檢及產前診斷非常重要。近十幾年來，許多分生技術皆針對此一目的進行研發。但大部分方法皆只針對SMN1及SMN2的第7外顯子內的一個核苷酸變異，進行鑑別分析。其中，SSCP方法較簡單，但靈敏度不高；PCR-RFLP是目前最普遍應用的方式，雖然此法可診斷出大部分的SMA患者，但對於SMA缺失型帶因者與非帶因者之間卻不易區分清楚。而MLPA技術可於單一PCR反應中，以一對PCR核酸引子檢測多達38個不同DNA片段序列。本研究可同時檢測SMN1第7及第8外顯子、SMN2第7及第8外顯子的專一序列，以及SMN1及2 第 1、4、6及8外顯子內之相同序列。另外，同時也檢驗SMN基因上下游附近的8個區塊及位於其他染色體上的22個對照區塊。所以，單一MLPA檢驗很多處基因內外對照區，大大提高檢驗品質及資料的正確性。
這些對照探針可同時監控DNA量是否足夠，連接及放大反應效率是否正常。好的反應其對照組探針訊號比值的標準差會小於0.1。分析數據若不好，可依資料上呈現的問題，進行校正及改進。改進方法包括重新反應PCR、重做全部反應，甚至重新萃取DNA，以得到較好的數據及正確的結果。一般SMN1及SMN2 的套數可依其個別的第7及第8外顯子的比值來直接判斷，但也要比對SMN1合併SMN2的第 1、4、6、8外顯子的平均比值所得出的套數總和，三者之間必須吻合。此外，我們也可比較SMN1與SMN2第7外顯子的套數比與SMN1與SMN2第8外顯子的套數比是否不同。在第一組中，有8名即屬於混合型基因型別(表1)。
分析SMN附近的基因套數，除可幫助我們確認SMN基因是否缺失外，亦可了解基因缺失的範圍。若患者基因缺失範圍包含BIRC1基因及GTF2H2基因時，其臨床症狀表現會更嚴重。若患者有較多套數的SMN2基因，其臨床症狀會較輕微。
第三組中的19名受檢者以DHPLC方式檢測出為帶因者，有3名受檢者的MLPA檢測結果為非帶因者。其中2名MLPA檢測結果為2:3，1名為2:4(表4)。本文投稿之後，陸續收到另外12名以DHPLC檢測為帶因者，經MLPA檢驗後6名為非帶因者。其中5名DHPLC檢測為1:2，MLPA結果為2:3；1名DHPLC檢測為1:1，MLPA結果為2:2。這些MLPA檢測出的SMN基因套數總和為4、5和6，此結果與SMN1/SMN2探針(exon 1、4、6及8)分析出的套數總和一致。甚至重覆再做一次檢測，結果都相同。這種將非帶因者檢測為帶因者的情形，極易造成受檢者嚴重的焦慮感。而另外有2名受檢者，其DHPLC檢測出的SMN2套數與MLPA結果不同，雖然SMN2基因的重要性較低，這樣的結果顯示DHPLC確實比較容易發生誤差(表4)。目前國內生技公司以DHPLC技術篩檢SMN基因的流程主要是依據台大基因醫學部發表的論文所建立。它們的篩檢流程可分為兩階段：(1)未加入內對照組探針，僅分析SMN1/SMN2的比值，若小於1，即判定為帶因者。(2)加入兩個對照組探針CYBB及KRIT1基因，以區別受檢者SMN基因比值為2:2或1:1(若未加則無法區分兩者差異)。從我們得到的DHPLC分析結果來看，生技公司似乎多只採用第1階段流程篩檢，除非受檢者的SMN基因套數為2:2，才會進行第2階段篩檢。如此便很難區別1:2帶因者與2:3或2:4的非帶因者。我們相信，DHPLC若能嚴謹的採用第2階段篩檢流程，應會大幅減少此一錯誤的發生。反觀MLPA加入了位於SMN基因區塊及其他染色體上的數十個對照組探針，所以在分析SMN基因套數時，提供非常好的品管控制。相對於DHPLC兩階段篩檢方式，MLPA準確度及效率顯然高出很多。
為了避免檢驗SMN1基因套數時發生錯誤，我們應做詳細的分析，以了解可能發生誤差的原因。DHPLC技術是一種非常簡便的SMA帶因者篩檢方式，但若不是由技術純熟、經驗豐富的技術人員操作分析的話，非常容易發生篩檢誤差。第三組中DHPLC結果與MLPA不一致的受檢者，也許可以再作進一步的分析檢驗。但我們相信MLPA結果的準確性應比較高。
大約5%的SMN突變屬於基因內的點突變，目前以MLPA及DHPLC篩檢技術都無法檢測出這類問題。未來我們希望能發展出更完整的篩檢流程，來涵蓋所有的SMA致病突變。如同MLPA技術應用於其他疾病的檢驗，利用MLPA技術分析SMN1及SMN2基因套數也是一種簡單、快速及準確的檢驗方式。我們相信，在SMA病患診斷及帶因者的篩檢上，MLPA技術一定會扮演非常重要的角色。
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